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version anglaise/english page :

A biocompatible polymer p(HEMA)

by Daniel CHAPPARD

GEROM-LHEA, CHU Angers           Updated: 20 january 2014

 

Biomatériaux de substitution du tissu osseux 

De nombreux biomatériaux sont à l'heure actuelle disponibles comme substituts du tissu osseux. Ils sont utilisés soit en chirurgie orthopédique (comblements de lacunes osseuses, reprises de prothèses, ostéotomie...), en neurochirurgie (arthrothèses vertébrales), en chirurgie reconstructrice, ainsi que dans le domaine dentaire en particulier dans le domaine de la parodontologie et de l'implantologie. A l'exception de l'autogreffe, dont le volume est nécessairement limité et qui pose des problèmes de prélèvement, aucun des biomatériaux disponibles à l'heure actuelle n'est ostéoinducteur. De plus, seules les allogreffes et les xénogreffes osseuses purifiées présentent une résistance mécanique suffisante pour pouvoir être mis dans des sites en charge. Ces matériaux sont ostéoconducteurs et permettent une régénération osseuse guidée en grande partie par l'architecture du matériau, son état physico-chimique de surface. Selon leur nature biochimique, ces matériaux sont d'ailleurs plus ou moins résorbables. Il apparaît clairement à l'heure actuelle qu'il existe une nécessité d'amélioration des matériaux osseux implantables de façon :

  1. à augmenter l'adhérence des ostéoblastes à leur surface,

  2. à provoquer la différentiation in situ des précurseurs ostéoblastiques en ostéoblastes actifs,

  3. à augmenter localement l'activité sécrétrice des ostéoblastes.

Il existe donc une demande pour la mise au point de biomatériaux de substitution synthétiques. Les polymères peuvent représenter une solution prometteuse.

 


Phosphatase alcaline dans des cellules ROS 17/2.8
(microscopie confocale)

Le poly (2-hydroxyéthyl) méthacrylate

Le (2-hydroxyéthyl) méthacrylate (HEMA) (anciennement et improprement nommé glycol méthacrylate ou GMA) est un monomère hydrosoluble, pouvant polymériser dans certaines conditions à basse température (de -20°C à + 10°C), il peut être utilisé pour fabriquer des hydrogels, immobiliser des protéines ou des cellules. Il est largement utilisé en médecine comme biomatériau [1-2]. La présence de radicaux hydroxyéthyl assure l'hydrophilie du polymère, sa biocompatibilité, mais aussi permet localement le recrutement d'ions calcium nécessaires à l'initialisation de la minéralisation après modification. Selon la quantité d'eau mise en place au cours de la polymérisation, on peut obtenir un polymère possédant une dureté identique voire supérieure à celle du tissu osseux. Ce polymère peut être dégradé par les cellules de la lignée monocytes-macrophages qui assurent donc une résorption du produit in vivo.

Le couplage entre protéines et pHEMA

Ce couplage peut être réalisé à basse température de façon à préserver la structure et l'activité biologique des protéines. La polymérisation est alors effectuée à basse température, en milieu contrôlé et par un mécanisme de type rédox. La phosphatase alcaline (AlkP) (EC 3.1.3.1.) est une phosphohydrolase capable d’hydrolyser les mono-esters orthophosphoriques à pH alcalin (pH compris entre 7,6 et 8,5). La phosphatase alcaline est une enzyme physiologiquement élaborée par les ostéoblastes et les chondrocytes qui est capable d’assurer la minéralisation du tissu osseux et du tissu cartilagineux. La répartition de la protéine au sein du polymère est homogène.

Lorsque des fragments de polymère pHEMA - AlkP alcaline sont mis à incuber dans un liquide biologique, reproduisant la composition ionique des fluides extra-cellulaires, des dépôts de cristaux de phosphate de calcium sont observés à la surface ainsi qu’en profondeur du matériau. A l'inverse; les lamelles de pHEMA seul ne comportent aucun précipité de phosphate de calcium à leur surface. La cartographie EDX de tranches de polymère recouvertes de cristaux de phosphate de calcium (rapport C/a/P=1,47) montre que ceux-ci se développent à partir d’une profondeur de 30µm environ puis qu’ils finissent par se développer à la surface du matériau pour former des nodules. Les cristaux apparaissent composés de phosphate octacalcique hydraté Ca8H2(PO4)6, 5H2O, de phosphate tri-calcique hydraté Ca3(PO4)2, xH2O et d’hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2. Ils ont une morphologie et une composition que l’on retrouve dans les tissus calcifiés humains et en particulier au niveau du cartilage de croissance foetal ou de l'os non lamellaire (woven bone).


Répartition homogène de AlkP dans le pHEMA (analyse d'images)


Calcosphérites dans l'os foetal humain (MEB)


Calcosphérites développés sur pHEMA-AlkP (MEB)

 

Bisphosphonates, croissance cristalline et matériau pHEMA-AlkP

Le biomatériau pHEMA-AlkP est un modèle acellulaire intéressant pour l'étude des processus de minéralisation. Il peut donc être utilisé pour apprécier le rôle de facteurs pharmacologiques et environnementaux directement sur les cristaux d'hydroxyapatite et non indirectement via les cellules. Les bisphosphonates sont des composés pharmacologiques caractérisés par une séquence P-C-P présentent une analogie structurale avec le pyrophosphate (P-O-P). A la différence de celui-ci, ils sont résistants à une hydrolyse enzymatique de type phosphatase.  Nous avons montré l’influence de trois bisphosphonates (étidronate, alendronate et tiludronate) sur les processus de minéralisation avec ce modèle acellulaire de minéralisation. Nous avons pu comparer les résultats obtenus sur terre et dans des conditions de microgravité au cours du vol STS80 de la navette spatiale américaine (décembre 1996). Les tranches de polymère ont séjourné dans des enceintes conçues pour ce type d'expérimentation (DMDA, Dual Materials Dispersion Aparatus - ITA, Instrumentation Technology Associated Inc)., Exton, PA) et la durée du vol a été de 17 jours.
L'activité de la phosphatase alcaline est totalement inhibée à une concentration de 10‑4 mg/ml par chacun des bisphosphonates à une concentration de 10‑2 M. Cette inhibition serait liée à la chélation des ions Zn2+ qui interviennent comme cofacteur enzymatique. L'étidronate et l'alendronate inhibent la formation de calcosphérites par ce mécanisme. Par contre, le tiludronate a un effet moins important à des concentrations similaires sur la cristallisation du phosphate de calcium dans ce modèle. Dans des conditions de microgravité (vol STS-80 de la navette spatiale américaine) la minéralisation a été fortement diminuée en présence d’étidronate alors que des cristaux plus larges ont été obtenus en présence de tiludronate. Cependant ces résultats ont été obtenus dans des conditions non physiologiques (température d’incubation de 20°C au cours du vol spatial). Le biomatériau (pHEMA-AlkP) permet d’étudier le rôle de certains facteurs pharmacologiques et environnementaux sur les processus de minéralisation dans un système acellulaire qui simule la minéralisation observée au niveau du cartilage et du tissu osseux normal.


etidronate de sodium

 

 

Matériau pHEMA-carboxyméthylé et minéralisation en présence d'ions métalliques et de protéines

La carboxyméthylation du pHEMA confère à celui-ci la propriété de pouvoir induire la calcification en l'absence de cellules et de protéines. La greffe de groupements carboxyméthyle sur la fonction hydroxyle du polymère induit la minéralisation après immersion dans un milieu synthétique (body fluid) [15]. La minéralisation du pHEMA imite la calcification du woven bone humaine avec la formation de calcosphérites. Ce modèle a permis de comprendre l’action de différents ions métalliques ou molécules pendant la calcification.

Le rôle du Fer: In vitro, les ions Fe2+ s’intègrent dans les cristaux d’HAP et induisent une inhibition de la croissance cristalline ainsi qu’une altération de la cristallinité et des propriétés mécaniques des cristaux [26]. Le fer est hyper-absorbé au cours de l'hémochromatose qui s'associe à une ostéoporose. Cliniquement, les patients présentent des dépôts de fer dans la matrice osseuse.

Le rôle du Co2+, Cr3+ et Ni2+, très utilisés dans les prothèses orthopédiques, ont été mis en contact avec le pHEMA durant la calcification [27]. En présence de ces ions, la taille des calcosphérites formées est considérablement augmentée par rapport aux contrôles, ainsi que la cristallinité du minéral formé. Les paramètres de maille du cristal d’HAP ont aussi subi une modification indiquant une possible altération du minéral osseux.

Le rôle du strontium : Le strontium Sr2+ est un ion qui a été utilisé comme traitement de l'ostéoporose car il est lui aussi capable de venir se fixer sur le cristal d’hydroxyapatite. Nous avons montré que cette fixation est faible et qu'il peut en être facilement délogé [29].

Le rôle de l'aluminium: L'aluminium rentre dans la composition de nombreux alliages comme le TA6V mais aussi dans des céramiques d'alumine utilisées comme biomatériaux. C'est un ion qui a est capable de venir se fixer sur le cristal d’hydroxyapatite en complexant aux phosphates. Cliniquement, les patients qui présentaient une insuffisance rénale chronique et qui étaient dialysés avec de l'eau contenant de grandes quantités d'aluminium ont présenté des troubles de minéralisations avec dépôts d'aluminium dans la matrice osseuse (dans les années 1970-1980). Actuellement, on rencontre encore des ostéoporoses aluminiques en cas de troubles digestifs lorsque les patients consomment beaucoup de pansements gastriques contenant de l'alumine. Le pHEMA carboxyméthylé a permis de montrer que de très faibles quantités d'ion aluminium, voire même l'adjonction de feuilles d'aluminium commercial dans le milieu d'incubation, entraînait une profonde inhibition de la calcification [30].

Ce modèle de calcification du pHEMA fonctionnalisé à permis de mettre en évidence l’adsorption de protéines non-collagéniques de la matrice osseuse à la surface du minéral formé. En présence d’ostéocalcine, les calcosphérites doublent de taille alors que le rapport Ca/P et les concentrations en Ca et PO4 ne changent pas. En présence de fétuine, les calcosphérites sont de plus petits, le rapport Ca/P augmente et les concentrations en Ca et PO4 diminuent. L'adsorption des protéines a été réalisée en spectroscopie Raman [28].

aluminum

A) calcosphérites témoins B) après incubation avec 40g/L d'ion Al3+, C) après incubation avec 6 feuilles d'aluminium du commerce (10 x 20 mm) (MEB).

 

Matériau pHEMA-AlkP et adhérence des cellules ostéoblastiques

Les cellules osteoblast-like s’étendent mal à la surface du pHEMA. Sur les pastilles de biomatériau pHEMA-AlkP recouvertes de cristaux de phosphate de calcium, on constate que les cellules émettent de nombreux filopodes et pseudopodes qui viennent s’amarrer préférentiellement à la surface des cristaux. La mesure du nombre de filopodes, de pseudopodes et de calcosphérites a été réalisée en analyse d'images. Le nombre de filopodes par cellule est plus important au niveau des pastilles revêtues de cristaux. 

L'adhérence des ostéoblastes est liée à la présence de Bone Sialoprotein et de Fibronectine adsorbés à la surface des calcosphérites. Des molécules ont été mises en évidence par microscopie confocale en utilisant des anticorps marqués. La BSP et la fibronectine peuvent être présentes dans le milieu de culture mais elles sont aussi synthétisées par les ostéoblastes qui les libèrent sur place. BSP et fibronectine ont se sont retrouvées que sur les calcosphérites et non sur le polymère. La confirmation a été apportée par microscopie électronique avec immunomarquage [14].

 


Cellule ROS 17/2.8 sur du pHEMA-AlkP
avec des calcosphérites



Cellule  sur du pHEMA-AlkP avec des calcosphérites étudiée en analyse d'images;filopodes en jaune, peudopodes en vert, calcosphérites rose et orange

Matériau pHEMA et macroporosité

Un biomatériau destiné à être mis en place en site osseux doit présenter une porosité suffisante pour que les vaisseaux sanguins et les cellules osseuses puissent le coloniser rapidement. On sait que la taille minimale des pores doit être supérieure à 100mm et la colonisation est favorisée par l'interconnection des pores. Aucune méthode de préparation de pores interconnecté n'a été mise au point et publiée dans la littérature. Nous avons développé une technique permettant de réaliser de véritables chenaux interconnectés dans un matériau polymère, en particulier dans un polymère hydrophile [10].

La porosité a été mesurée en microtomographie X (Skyscan 1072).

L'interconnectivité de la porosité a été mesurée par analyse d'images à l'aide d'algorithmes décrits pour la caractérisation de la microarchitecture du tissu osseux (Microsc. Res. Techn. 45, 303-312, 1999; J. Pathol. 195, 515-521, 2001).

La diffusion des liquides a été montrée en utilisant une technique qui modifie l'état de surface du polymère et permet la greffe de radicaux carboxyliques visualisables en histochimie.

 


Bloc de pHEMA avec porosité interconnectée. Etude en microtomographie X. Le polymère est visualisé en bleu avec un effet de transparence qui laisse apparaître les chenaux interconnectés (en vert)

Bloc de pHEMA avec porosité non-interconnectée. Etude en microtomographie X. Le polymère est visualisé en violet avec un effet de transparence qui laisse apparaître les vides laissés par les billes de porogène (en jaune)

  Matériau pHEMA et groupements phosphatés

L'utilisation de groupements phosphates à la surface du polymère permet-t-elle d'augmenter la minéralisation de ce type de polymère ? La calcification des matrices organiques (os, dent...) utilise des phosphoprotéines qui servent à induire la minéralisation. Nous avons réalisé des copolymères contenant des groupements phosphatés (MOEP = methacryloyloxyéthyl phosphate). La calcification des polymères contenant du MOEP est importante in vitro comme ont pu le mettre en évidence des incubations d'éprouvettes de polymère dans un fluide biologique ayant la même composition que le plasma [17]. Les taux de réactivité du MOEP avec le 1-vinyl-2-pyrrolidinone ou le (diethylamino)éthyl méthacrylate ont été calculés pour obtenir des polymères biocompatibles.

Lorsque le copolymère MOEP +  1-vinyl-2-pyrrolidinone est implanté dans une lacune crânienne réalisée chez le rat, on constate que les particules de polymère sont fortement calcifiées trois mois après l'implantation [18]. La possibilité de fabriquer des microbilles à base deu copolymère HEMA-MOEP a été décrite [25].

 

      Minéralisation sur un bloc de  MOEP-co-NP contenant des groupements phosphatés

  Le pHEMA est-il résorbable in vivo et in vitro ?

La biodégradabilité des polymères in vivo est un problème important. Elle peut être souhaitable dans certaines circonstances lorsque le biomatériau doit se substituer de façon temporaire à un tissu du corps humain (ex : matériau de greffe osseuse) ou être indésirable lorsque celui-ci doit suppléer à long terme une fonction (ex : lentille intra-oculaire).

 Nous avons montré que la présence d'un réticulant (éthylène glycol diméthacrylate) influençait considérablement les propriétés d'hydratation du polymère (mesures en microscopie de force atomique - AFM).

De plus, in vitro, les cellules macrophagiques J774.2 s'activent au contact de billes de polymère réticulé ou non réticulé mais des images de phagocytose du polymère ne sont observées qu'en l'absence de réticulant. Dans ce cas là, les couches périphériques du polymère sont fortement hydratées ce qui facilite la résorption du matériau [19]. Le pHEMA apparaît donc comme un polymère érodable, en particulier lorsqu'il est sous forme linéaire (non réticulée).

 

Aspect en AFM de la surface d'une éprouvette de pHEMA non réticulé sec (haut)
et hydraté (bas)

  Topographie de surface du pHEMA sec et hydraté

La topographie de surface d'un matériau implantable est un paramètre important à prendre en compte dans l'appréciation de la biocompatibilité. La rugosité de surface, par exemple, peut conditionner notablement l'adhérence de certains types cellulaires (fibroblastes, ostéoblastes). La rugosité de surface d'un matériau peut être visualisée par de nombreuses méthodes comme la microscopie électronique à balayage (MEB). Cependant, il est souvent important de mesurer la rugosité; des méthodes comme la profilométrie de contact, la profilométrie optique ou la microscopie de force atomique (AFM) sont capables de mesurer la rugosité moyenne (Ra, dimension fractale...). Toutefois, ces méthodes sont difficilement applicables au hydrogels fortement hydratés (déshydratation indispensable pour le MEB, "engluage" des pointes de profilométrie ou d'AFM). Des technologies nouvelles comme la microscopie environnementale peuvent permettre une visualisation mais ne donnent pas de quantification de la rugosité.

Nous avons montré que l'analyse de texture appliquée aux images de la surface de polymères hydrophiles, constituait une méthode simple d'appréciation de la rugosité. Lorsque la surface d'un polymère hydrophile est visualisée en lumière rasante (angle de 30° par exemple), les détails de sa surface  sont clairement mis en évidence. Quand le polymère est placé dans une solution aqueuse, la relaxation des chaînes superficielles efface ce relief [20]. L'adjonction d'un réticulant limite le gonflement du polymère. Lorsque des images de la surface du polymère sont réalisées à des temps successifs d'hydratation, la mesure de la dimension fractale de ces images est hautement corrélée avec le taux de gonflement [21].

 

Aspect en lumière rasante de la surface d'une éprouvette de pHEMA  sec (A) et après deux heures d'hydratation (B)

Immobilisation de molécules protéiques bioactives dans le pHEMA

Les biomatériaux, et particulièrement les polymères, peuvent être utilisés comme support pour effectuer une libération contrôlée de molécules. L'intérêt de ce type de vecteur est important si on envisage la libération de protéines bioactives dans des sites osseux, en particulier pour assurer le comblement de larges défauts osseux. Nous avons montré que le pHEMA pouvait être polymérisé à basse température pour l'immoblisation de protéines, et en particulier d'un facteur de croissance connu pour les ostéoblastes : le basic fibroblast growth factor (FGF-2). Des cylindres de pHEMA contenant la protéine ont été implantés dans des lacunes de taille supra-critiques forées dans l'extrémité fémorale inférieur du fémur chez le lapin. La réparation osseuse a été suivie par microtomographie computérisée (microCT) qui permet de mesurer la quantité d'os formée ainsi que de visualiser la forme du réseau trabéculaire néo-formé autour du greffon. Au bout de 2 mois post-chirurgie, un très fin lacis de travées composées d'os fibreux non lamellaire est observé à la surface des cylindres implantés (qui sont radiotransparents). Ce délicat encorbellement est bien visible sur l'image ci contre où la moitié antérieure de l'os et du cylindre ont été éliminées de l'image [22].

 

Aspect de l'os formé à la surface d'un cylindre de pHEMA permettant la libération contrôlée de FGF-2

  Nouveau couple initiateur/accélérateur de polymérisation  peu cytoxique

La polymérisation du HEMA est le plus souvent réalisé selon un mode radicalaire  en utilisant des radicaux libres provenant d'une réaction rédox. Dans une réaction rédox, un accélérateur de polymérisation (habituellement le peroxyde de benzoyle - BPO) est fragmenté par un initateur (une amine substituée comme la NN-diméthyl aniline ou la NN diméthyl paratoluidine) pour générer des radicaux libres. Ceux ci provoquent alors l'ouverture de la double liaison d'une molécule de monomère et le radical libre est transmis à cette molécule de monomère qui va, en cascade, pouvoir interagir avec une autre molécule  de monomère  auquelle elle se fixe en lui transmettant le radical libre. L'inconvénient de l'utilisation des amines substituées est qu'elles génèrent aussi des composés brunâtres qui ont des propriétés irritatives. De plus, la polymérisation induite par le couple benzoyle de peroxyde/amine libère une grande quantité de chaleur et est très rapide. Nous avons décrit un nouveau couple initiateur/accélérateur de polymérisation basé sur l'emploi de l'acide ascorbique (vitamine C) et du peroxyde de benzoyle. Le cinétique de la réaction a été suivie par microscopie Raman qui permet d'objectiver la disparition de la double liaison C=C au cours du temps. L'analyse a aussi montré qu'une fonction -COOH apparaissait sur le polymère et provient de la fragmentation de l'acide ascorbique [23].

Cinétique de la polymérisation rédox du pHEMA en présence de peroxyde de benzoyle décomposé par l'acide ascorbique. Microspectroscopie Raman.

   

 

Préparation de microbilles de pHEMA ionisées

Le pHEMA peut être polymérisé en suspension de façon à préparer des microbilles. Nous avons réalisé des microbilles de pHEMA porteuses de charges positives (par copolymérisation avec du 2-(méthacryloyloxy) éthyl acétoacétate (MOEAA) ou négatives par copolymérisation avec du chlorure de diallyldiméthylammonium (DADMAC). Ces microbilles ont été rendues fluorescentes par incorporation d'un fluorochrome (Nile Red).

 

 L'incorporation de microbilles à une culture de cellules endothéliales a montré que les microbilles étaient internalisées rapidement par les cellules. L'analyse en  microscopie électronique à transmission et en  microscopie confocale a bien montré la localisation intracellulaire des microbilles. Les microbilles chargées négativement semblent plus facilement internalisées par les cellules endothéliales.

 

 

Les microbilles peuvent être utilisées pour le ciblage de l'angiogenèse tumorale car elle peuvent s'accumuler dans les tissus par effet EPR (Enhanced permeability retention) [24].

Microscopie confocale et reconstruction 3D de cellules endothéliales EA.hy 926 (pseudocouleur verte) cultivées en présence de microbilles de pHEMA fluorescentes (pseudocouleur rouge). Image du haut : seules les microbilles en position extracellulaire sont visibles, image du bas : le cytoplasme  est rendu transparent de façon à visualiser les microbilles en situation intracellulaire.
     
Les travaux de l'Unité 922 et GEROM sur les matériaux pHEMA et pHEMA-AlkP :

Ces travaux ont été réalisés dans le cadre du Contrat de Plan Etat-Région(CPER) des Pays de La Loire

  1. Chappard D, Laurent JL, Camps M, Montheard JP. A simple and reliable method for purifying glycol methacrylate for histopathological studies. Acta Histochem. 71, 95-102, 1982.

  2. Chappard D, Alexandre C, Palle S, Montheard JP, Riffat G. Improved stability of a purified glycol methacrylate preparation: comments. Stain Technol. 61, 185-186,1986

  3. Chappard D, Alexandre C, Camps M, Montheard JP, Riffat G. Embedding iliac bone biopsies at low temperature using glycol and methyl methacrylates. Stain Technol. 58, 299-308, 1983.

  4. CHAPPARD D., ALEXANDRE C., RIFFAT G. Orientation and handling of large blocks during embedding in Glycol-methacrylate (GMA) for High Performance Optical Microscopy. Mikroskopie, 41; 1-3, 1984.

  5. CHAPPARD D., BENASCAR Z., ALEXANDRE C., MONTHEARD J.P. Practical investigation of radical polymerization of glycolmethacrylate as an embedding medium. J. Histotechnol. 12, 89-94, 1989.

  6. CHAPPARD D., MONTHEARD ;J.P., CHATZOPOULOS M., ALEXANDRE C., Utilisations biomédicales d'une résine hydrophile : le 2-hydroxy éthylméthacrylate. ITBM Innovation et Technologie en Biologie et Médecine 13, 322-340, 1992.

  7. MONTHEARD J.P., CHATZOPOULOS M., CHAPPARD D., 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA): chemical properties and applications in biomedical fields. J. Macromol. Sci., Macromol. Rev. 32, 1-34, 1992.

  8. MONTHEARD J.P., KAHOVEC J., CHAPPARD D., Homopolymers and copolymers of 2-hydroxyethyl Methacrylate for biomedical applications. In «Desk reference of functional polymers; Syntheses and applications» Arshady R., Ed. American Chemical Society, Washington DC, Chapter 5.3, 699-717, 1997.

  9. FILMON R., CHAPPARD D., MONTHEARD J.P., BASLE MF. A composite biomaterial: poly 2(hydroxyethyl) methacrylate / Alkaline phosphatase (pHEMA / AlkP) initiates mineralization in vitro. Cells Mater. 6, 11-20, 1996.

  10. FILMON R., CHAPPARD D., BASLE MF. Scanning and Transmission Electron microscopy of poly 2(hydroxyethyl) methacrylate-based biomaterials. J. Histotechnol., 20, 343-346, 1997.

  11. Chappard D, Gaborit-Retailleau N, Montheard JP, BaslE MF. Photo polymerized 2-hydroxyethyl methacrylate is a mounting medium preserving immunocytochemical reaction and nuclear counterstain. Biotech. Histochem. 74, 135-140, 1999.

  12. Filmon R, Basle MF, Barbier A, Chappard D. Etude in vitro de l'influence des bisphosphonates sur la mineralisation induite par un materiau composite : le poly (2-hydroxyethyl) methacrylate couplé à la phosphatase alcaline. Morphologie, 84, 23-33, 2000.

  13. Filmon R, Basle MF, Barbier A, Chappard D. Poly 2(hydroxyethyl) methacrylate- alkaline phosphatase: a composite biomaterial allowing in vitro studies of bisphosphonates on the mineralization process. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 11, 849-868, 2000.

  14. Filmon R, Basle MF, Atmani H, Chappard D. Preferential adherence of osteoblast-like cells on calcospherites developed on poly (2-hydroxyethyl) methacrylate-AlkP biomaterial. Bone 30,152-158, 2002.

  15. Filmon R, Grizon F, Basle MF, Chappard D. Effects of negatively charged groups (carboxymethyl) on the calcification of poly (2-hydroxyethyl) methacrylate Biomaterials, 23, 3053-3059, 2002.

  16. Filmon R, Retailleau-Gaborit N, Grizon F, Galloyer M, Cincu C, Basle MF, Chappard D Non-connected versus inter-connected macroporosity in poly (2 hydroxyethyl methacrylate) polymers. A X-ray microtomographic and histomorphometric study. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 13, 1105-1117, 2002.

  17. STANCU I.C., FILMON R., CINCU C., MARCULESCU B., ZAHARIA C., TOURMEN Y., BASLÉ M.F., CHAPPARD D. Synthesis of methacryloyloxyethyl phosphate copolymers and in vitro calcification capacity. Biomaterials 25,205-213, 2003.

  18. Stancu IC, Filmon R, Grizon F, Zaharia C, Cincu C, Basle MF, Chappard D. The in vivo calcification capacity of a copolymer, based on methacryloyloxyethyl phosphate, does not favor osteoconduction. J Biomed. Mater. Res. 69A, 584-589,

  19. Mabilleau G, Moreau MF, Filmon R, Basle MF, Chappard D. Biodegradability of poly (2-hydroxyethyl methacrylate) in the presence of the J774.2 macrophagic cell line. Biomaterials 25, 5155-6512, 4.

  20. Mabilleau G., Stancu I. C., Honoré T., Legeay G., Cincu C., BaslE M.F., CHAPPARD D. Effects of the chain length of cross-linkers on poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) swelling and biomechanical properties J. Biomed. Mater. Res A., 77: 35-42, 2006.

  21. Mabilleau G., BaslE M.F., CHAPPARD D. Evaluation of surface roughness of hydrogels by fractal texture analysis during swelling. Langmuir, 22, 4843-4845, 2006.

  22. Mabilleau G., Aguado E., Stancu I.C.CINCU C., BaslE M.F., Chappard D. Effects of FGF-2 release from a hydrogel polymer on bone mass and microarchitecture. Biomaterials, 29, 1593 – 1600, 2008.

  23. Mabilleau G., Cincu C., BASLE M.F., CHAPPARD D. Polymerization of 2- (hydroxyethyl) methacrylate by two different initiator / accelerator systems: a Raman spectroscopic monitoring. J. Raman Spectroscopy, 39, 767–771, 2008.

  24. NYANGOGA H., ZECHERU T., FILMON R., BASLÉ M.F., CINCU C., CHAPPARD D. Synthesis and use of pHEMA microbeads with human EA.hy 926 endothelial cells.J Biomed Mater Res Part B: Appl. Biomater. 89, 501-507, 2009.

  25. ZECHERU T., SĂLĂGEANU A., CINCU C., CHAPPARD D., ZERROUKHI A. Poly(HEMA-co-MOEP) microparticles: Optimisation of the preparation method and in vitro tests. UPB Scientific Bul., Series B: Chem. Mater. Sci. 70, 45-54, 2008.

  26. GUGGENBUHL P., FILMON R., MABILLEAU G., M.F. BASLE., CHAPPARD D. Iron inhibits hydroxyapatite crystal growth in vitro. Metabolism. 57, 903-910, 2008.

  27. MABILLEAU G., FILMON R., PETROV P.K., BASLE M.F., SABOKBAR A., CHAPPARD D. Cobalt, chromium and nickel affect hydroxyapatite crystal growth in vitro. Acta Biomater. 6, 1555-1560, 2010

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