HélèneLibouban, Daniel Chappard

MAJ 22/03/2017

 

 

Le myélome est une hémopathie maligne dont la prévalence est de 1 sur 10 000 personnes ; la médiane de survie est d’environ 3 ans. La maladie est caractérisée cliniquement par des douleurs osseuses et une asthénie. Biologiquement, on retrouve une protéine monoclonale dans le sang et/ou les urines dans 98% des cas. Les anomalies squelettiques (foyers ostéolytiques, ostéolyse diffuse) sont observées sur les radiographies dans 90% des malades (figure 1). Une hypercalcémie, qui est le reflet de la lyse osseuse, est souvent associée. L’ostéolyse du myélome entraîne des troubles cliniques graves (fractures, compressions médullaires, douleurs osseuses rebelles…). La physiopathologie et l’étiologie de l’ostéolyse au cours du myélome sont encore imparfaitement connues.  

Il a été montré que la destruction du tissu osseux n’était pas liée aux cellules plasmocytaires tumorales elles-mêmes, mais à une stimulation de l’activité ostéoclastique qui survient au voisinage des nodules tumoraux [1 , 2] . Les plasmocytes tumoraux humains élaborent de nombreux facteurs locaux (cytokines) qui stimulent l’activité ostéoclastique : interleukine-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6) et son récepteur soluble (IL-6Rs), TNFa (tumor necrosis factor a). Cependant, aucun de ces facteurs n’apparaît être seul responsable de la destruction osseuse. D’autre part, le micro-environnement médullaire peut influer : les macrophages, par la production de MIP-1α ; les cellules stromales médullaires (précurseurs ostéoblastiques) ainsi que les ostéoblastes, par la production de RANK ligand (RANKL) impliqué dans le recrutement des précurseurs ostéoclastiques. Dans le myélome, plusieurs études suggèrent une augmentation de la production de RANKL par les cellules stromales en réponse aux cellules plasmocytaires. De même, l’interaction des cellules stromales avec les plasmocytes tumoraux (par l’intermédiaire de molécules d’adhésion telles que VCAM-1/VLA4) induit la production d’IL-6 par les cellules stromales. L’IL-6 en association avec son récepteur soluble favorise la prolifération et la survie des cellules tumorales [3] . Il existe donc, au cours du myélome, un véritable cercle vicieux où les cellules tumorales stimulent les cellules osseuses qui stimulent en retour la croissance tumorale. La compréhension des mécanismes tissulaires, cellulaires et moléculaires des interactions entre les plasmocytes tumoraux et les cellules osseuses souffre du peu de développent des modèles animaux. Ceux-ci peuvent être intéressants, d’une part pour aborder des problèmes de physiopathologie, d’autre part pour apprécier l’effet de thérapeutiques anti-ostéoclastiques ou anti-tumorales. A l’heure actuelle, seuls des modèles murins sont disponibles et reflètent de façon plus ou moins parfaite, la maladie humaine. Une revue générale sur les modèles animaux de myélome a été récemment publiée par notre groupe [15]. 

Induction de plasmocytomes chez la souris BALB/c 

L’injection de pristane (huile minérale) dans la cavité péritonéale de souris BALB/c est associée à une fréquence élevée d’induction de plasmocytomes. Les cellules plasmocytaires peuvent être ensuite transférées à d’autres souris préalablement traitées au pristane. Cependant, il s’agit d’un plasmocytome localisé dans le péritoine, et qui ne s’étend pas à la moelle osseuse ; il ne reproduit donc pas fidèlement le myélome humain. Ces plasmocytomes, qui secrètent majoritairement une IgA monoclonale, sont surtout intéressants pour étudier les réarrangements de l’oncogène c-myc [4, 5]

Les souris immuno-déficientes : le modèle SCID

Chez la souris SCID (Severe Combined Immunodeficiency), plusieurs groupes ont utilisé des xénogreffes de cellules plasmocytaires humaines. Cependant, le choix des lignées de plasmocytes tumoraux humains apparaît critique de par leur origine : myélomateuse ou lymphoblastoïde, et leur statut EBV- ou EBV+ (Epstein-Barr Virus). Ces cellules d’origine humaine colonisent le micro environnement médullaire et s’y développent. Des lésions ostéolytiques ressemblant à celles décrites chez l’homme sont alors observées, en même temps qu’une paraprotéine peut être dosée dans le sérum.  

Certaines de ces lignées, comme la lignée KPMM2, sont très bien caractérisées. KPMM2 est une lignée EBV- issue d’un patient atteint d’un myélome. Elle produit de l’IL-6 et une immunoglobuline monoclonale ; d’autre part la prolifération des ces cellules est spécifiquement dépendante de l’IL-6. L’injection de ces cellules en intraveineux chez la souris SCID est suivie par un développement important à l’intérieur de la moelle hématopoïétique et des ganglions. Des lésions ostéolytiques sont observées ; 30 à 40 jours après inoculation, les souris présentent une paralysie des membres postérieurs. D’autres équipes ont utilisé une lignée humaine de leucémie à plasmocytes, transformée par le virus d’Epstein Barr (ARH77). Les souris SCID développent une paralysie des membres inférieurs 28 à 35 jours après inoculation de cellules ARH77. Une hypercalcémie est observée dans les 5 jours qui suivent la survenue de la paralysie. L’examen histologique des différents organes montre une infiltration plasmocytaire du foie, de la rate, des vertèbres et des os longs. Dans ce modèle, il a été observé une augmentation significative des taux de MIP-1α dans le milieu médullaire. A l’inverse, les taux sériques ou médullaires de facteurs locaux tels que : IL-6, IL-1, TGFa, TNFa, lymphotoxine, PTHrp et HGH n’ont pas significativement augmenté, bien que les cellules ARH77 soient capables de synthétisées de l’IL-6 [3, 5] .  

D’autres facteurs, comme la voie d’inoculation, ont une influence sur le développement tumoral dans le modèle SCID. La voie intraveineuse est préférable et est associée à des lésions ostéolytiques typiques. L’injection intra-péritonéale s’accompagne de localisations pancréatiques, spléniques, hépatiques, intestinales, rénales mais la moelle osseuse n’est que rarement envahie. L’injection intra cardiaque ou en intra osseuse directe associe une croissance tumorale intramédullaire (avec des lésions ostéolytiques) associée à d’autres localisations [4]

Le modèle SCID peut être affiné en greffant aux animaux un fragment d’os fœtal humain qui apporte alors un « micro-environnement médullaire » favorable à la greffe des cellules plasmocytaires humaines. Ce modèle : SCIDhu est associé à un « homing » des cellules plasmocytaires tumorales humaines à l’intérieur du greffon osseux fœtal. C’est exclusivement dans ce greffon d’os xénogénique que se développe une importante activité ostéolytique [4] . Cependant, ce modèle est lourd à mettre en œuvre et se heurte à des problèmes éthiques. 

Avantages et inconvénients des modèles SCID 

L’utilisation de lignées de cellules plasmocytaires humaines est un avantage car des quantités importantes de cellules peuvent être injectées aux animaux : usuellement de 1 à 3.106 cellules sont utilisées. Dans ces modèles, la croissance tumorale est rapide puisque le stade terminal de la maladie est obtenu entre 30 à 40 jours. 

Ces modèles permettent de tester des agents actifs sur la croissance tumorale (daunorubicine, idarubicine, ifosfamide…). L’effet d’anticorps anti-IL-6 humain ou anti-IL-6 récepteur humain a été testé sur la croissance tumorale. Dans le modèle KPMM2, l’injection d’anticorps anti-IL-6 récepteur humain, réduit de façon notable le développement de la maladie [3] .

D’autre part, des thérapeutiques anti ostéoclastiques ont été utilisées. L’ibandronate a été testé sur les souris SCID ayant reçu des cellules ARH77 : le bisphosphonate entraîne une diminution des lésions ostéolytiques mais n’a aucun effet sur la croissance tumorale [5] . L’utilisation d’une forme soluble du récepteur RANK (RANK-Fc) dans le modèle SCIDhu empêche également la destruction osseuse. Ces modèles sont intéressants car ils sont associés à des lésions ostéolytiques qui ressemblent à celles obtenues au cours de la maladie humaine. Cependant il s’agit souvent, soit de cellules lymphoblastoïdes et non de plasmocytes vrais, soit de cellules B transformées par le virus d’Epstein Barr. D’autre part, dans le modèle ARH77, l’interleukine 6 ne semble pas jouer un rôle clef dans la croissance tumorale à la différence de celui observé chez l’homme.   

La lignée de souris C57BL/KalwRij 

Il s’agit d’un modèle murin décrit par Radl où les animaux développent spontanément des proliférations lymphocytaires monoclonales de la lignée B au cours du vieillissement (80% des animaux présentent une gammapathie monoclonale). Environ 1% de souris âgées présentent un myélome typique ou une maladie de Waldenström et un tiers des animaux ont un lymphome centrofolliculaire constaté à l’autopsie. Une douzaine de lignées plasmocytaires myélomateuses ont pu être isolées [6] . Après ré injection chez des souris indemnes, ces cellules se localisent dans la moelle hématopoïétique et reproduisent un myélome type. Le modèle apparaît relativement stéréotypé. Certaines lignées (5T2MM, 5T33) induisent des lésions ostéolytiques. D’autres (5T14MM) peuvent induire des lésions ostéocondensantes. Il s’agit donc dans ce cas là d’une allogreffe de cellules plasmocytaires tumorales chez la souris. Deux lignées ont été particulièrement étudiées : 5T2MM et 5T33MM. La lignée 5T2MM reproduit les lésions observées en clinique humaine. Sa croissance est lente, puisque la paraprotéine est observée à la 9ème semaine post-inoculation, les lésions ostéolytiques à partir de la 11ème semaine et le stade terminal à la 16ème semaine. La lignée 5T33MM est beaucoup plus agressive et peut aussi entraîner des localisations extra-médullaires [7] . Le stade terminal de l’affection est obtenu 4 à 5 semaines après inoculation. Les réseaux de cytokines mis en jeu sont voisins de ceux rencontrés dans la maladie humaine ; de plus les molécules d’adhérence de certaines de ces lignées sont semblables à celles observées dans le myélome humain : VCAM-1, pour l’adhérence intercellulaire ; a4/b1, pour l’adhérence à matrice osseuse. Radiographiquement, les lésions sont localisées au niveau des os longs (extrémité supérieure du tibia, extrémité inférieure du fémur, de l’humérus). Chez la souris, ces zones présentent physiologiquement un haut niveau de remodelage osseux, ce qui explique d’une part la localisation tumorale préférentielle, d’autre part la forte croissance tumorale. L’aspect des lésions ostéolytiques est particulièrement bien étudié en utilisant des appareils de radiographie numérique ou des films de mammographie : l’ostéolyse débute à la face endostéale des pièces osseuses (figure 2). Histologiquement, la moelle hématopoïétique est remplacée par des nodules tumoraux qui comblent la cavité médullaire au stade terminal de l’affection. En périphérie des nodules tumoraux, on note une augmentation considérable du nombre d’ostéoclastes, ceux-ci sont responsables de la résorption du tissu osseux trabéculaire ainsi que d’érosions de l’os cortical (figure 3). On note de façon constante des perforations corticales suivies d’extension tumorale à l’intérieur des parties molles). La microscopie à balayage objective bien la résorption endostéale : chez la souris contrôle, les surfaces érodées occupent 19,2 ± 7.1% des surfaces endostéales, chez les souris ayant reçu une greffe de cellules 5T2MM, les surfaces érodées sont à 76,2 ± 17,1 %. Le pourcentage des lésions radiographiques peut être quantifié en analyse d’images : en moyenne, 5,8 ± 1,7% de la surface du fémur est en voie de résorption [8] . La micro-tomographie X avec reconstruction 3D (microCT) permet de visualiser avec précision les foyers de résorption et confirme les observations radiologiques, histologiques (figure 4) . Nous avons développé une méthode d'analyse d'images qui permet de quantifier l'ostéolyse dans les fûts osseux qui sont assimilables à une structure tubulaire. La méthode consiste à dérouler les images de section 2D obtenues par microtomographie et de les transformer en surfaces planes plus faciles à quantifier (figure 4bis) [14]. 

Avantages et inconvénients de ce modèle. 

Le modèle 5T2MM reproduit le plus fidèlement les conditions physiopathologiques observées au cours de la maladie humaine ; les localisations tumorales se font exclusivement au niveau des organes hématopoïétiques (moelle et rate). Cependant, il s’agit d’un modèle lourd à mettre en œuvre. En effet, les cellules 5T2MM ne sont pas cultivables in vitro et la lignée tumorale doit être entretenue par passage chez l’animal ; de plus, le développement de la maladie est lent, ce qui correspond cependant à ce qui est observé chez l’homme. Plusieurs équipes ont tenté de développer d’autres modèles avec des sous-clones de la lignée cellulaire 5T33MM : le développement est plus rapide (4 semaines) et les cellules plasmocytaires tumorales sont cultivables in vitro [4] . Ces modèles s’avèrent très utiles pour étudier la physiopathologie et pour évaluer l’efficacité d’agents thérapeutiques sur les lésions ostéolytiques du myélome.  

L’effet de traitements combinant interféron-a et melphalan a été testé dans le modèle murin 5T33MM. Cette association réduit de façon significative la croissance tumorale et entraîne une augmentation de la survie des animaux. L’utilisation d’anticorps dirigés contre la paraprotéine IgG2aκ entraîne une réduction de la croissance tumorale chez la plupart des animaux [3]. Le modèle 5T33MM a été également utilisé pour produire un vaccin ADN couplé avec un fragment de la toxine tétanique [4] .  A la différence du myélome humain qui a une atteinte rénale liée au dépot de proteine monoclonale dans les glomérules rénaux, les souris myélomateuses ne développent pas d'altération histologiques du rein [12]. Les plasmocytes tumoraux sont capables de libérer dans la circulation des microparticules comportant des fragments de membrane plasmique comportant la molécule CD138 (syndécan); le rôle de ces microparticules dans l'extention de la maladie demeure mal connu [13].

Relations entre croissance tumorale et remodelage osseux 

Nous avons pu montrer que l'ovariectomie (OVX) chez les souris augmentait considérablement la croissance de la tumeur. On sait en effet que l'OVX stimule la production de cytokines médullaire, en particulier de l'IL-6 qui est un facteur de croissance tumoral. Une altération du microenvironnement provoqué par l'OVX s'est avérée capable de "booster" considérablement la croissance de la tumeur [10]. De plus, nous avons pu montrer que le micro-environnement médullaire était capable de sélectionner des clones très agressifs de cellules, ce qui nous a permis d'isoler une nouvelle lignée cellulaire (5THL) qui entraîne une ostéolyse importante et rapide sans développement de lésions extra-osseuses chez les souris [11].

De la même façon, une carence en calcium provoquée en fournissant des aliments pauvre en calcium aux souris augmente de façon considérable la croissance de la tumeur. Le mécanisme intime est le suivant : la carence en calcium entraine une hypersécrétion d'hormone parathyroïdienne, réaction physiologique destinée à augmenter les apports calciques et à stabiliser le taux de calcium sanguin. Cependant, l'hyperparathyroïdie ainsi générée stimule aussi considérablement le remodelage osseux. On aboutit ainsi à une os stimulé qui va lui même provoquer une accélération de la croissance du myélome avec des symptomes aggravés. Ceci confirme bien l'existence d'un "cercle vicieux" entre croissance tumorale et remodelage osseux (Figure 4 ter)[16].

Des thérapeutiques anti ostéoclastiques tels que les bisphosphonates ont été testées dans ces modèles. Initialement, c’est le pamidronate (APD, Figure 5) qui a été utilisé à la dose de 500, 2000 et 10 000 ppm mélangé à l’alimentation des souris 5T2MM. Chez les animaux traités, on constate une préservation de la masse osseuse et une restauration partielle des lacunes ostéolytiques par de l’os néoformé. Cependant, l’APD n’a pas d’effet sur la masse tumorale elle-même alors que des effets cytotoxiques pro-apoptotiques de l’APD ont été décrits in vitro sur les cellules myélomateuses. L’ibandronate a été testé dans les modèles 5T2MM et 5T33MM. Dans les 2 cas, le bisphosphonate a entraîné une réduction significative de la survenue des foyers ostéolytiques, cependant, aucun effet n’est noté sur la croissance tumorale ni la survie des animaux. Il est à noter que, dans ces modèles, les doses de bisphosphonates à employer sont en règle générale 100 fois supérieures à celles requises dans d’autres modèles animaux d’hyper résorption (du type rate ou souris ovariectomisée) [4] .   

Les modèles murins, en particulier le modèle 5T2MM, constituent un bon moyen d’étude pour apprécier les effets des bisphosphonates sur l’ostéolyse du myélome. L’utilisation de composés anti-ostéoclastiques en particulier de la classe des bisphosphonates, permet d’évaluer in vivo leur activité dans ce modèle si particulier d’ostéolyse tumorale. Plusieurs « générations » de bisphosphonates ont vu le jour au cours des dernières décennies. Les bisphosphonates dit de "première génération" comme l’étidronate ou le clodronate, ont été utilisés avec peu de succès dans le traitement du myélome humain. Du point pharmacologique, ils interviennent en induisant la formation de complexes anormaux avec l’ATP ou le GTP ; ces dérivés sont non hydrolysables et entraînent l’apoptose des ostéoclastes.

La "deuxième génération" de bisphosphonates (alendronate, ibandronate, résidronate….), agit en intervenant sur la voie métabolique du cholestérol au niveau de la prénylation des protéines. La prénylation consiste en la fixation de groupements isoprénoïdes sur les protéines qui fixent le GTP (comme Ras et Rho). Physiologiquement, ces protéines sont alors capables de s’ancrer sur la membrane plasmique, de participer au métabolisme cellulaire et d’inhiber l’apoptose. Les bisphosphonates de "deuxième génération" inhibent des enzymes clés du métabolisme du mévalonate et empêchent la production de farnésyl pyrophosphate et de géranylgéranylpyrophosphate, indispensables à la prénylation des protéines. L’altération de cette voie métabolique entraîne l’apoptose des ostéoclastes et donc une réduction de l’ostéolyse. Cependant, il ne semble pas y avoir d’effet notable sur les cellules plasmocytaires elles-mêmes. Il a été récemment montré que certains bisphosphonates de "troisième génération" comme l'acide zolédronique (Figure 6) pouvait entraîner l’apoptose des ostéoclastes mais aussi de certaines lignées de cellules tumorales plasmocytaires, de certaines lignées de cancers du sein et de cancers prostatiques [9] . L’utilisation des modèles murins de myélome doit donc permettre de juger de l’efficacité de ces nouveaux composés in vivo.

Reférences :

1) Mundy GR, Raisz LG, Cooper RA, Schechter GP, Salmon SE Evidence of the secretion of an osteoclast stimulating factor in myeloma. N Engl J Med 1974;291:1041-6.

2) Bataille R, Chappard D, Marcelli C, Dessauw C, Baldet P, Sany J, Alexandre C Recruitment of new osteoblasts and osteoclasts is the earliest critical event in the pathogenesis of multiple myeloma. J Clin Invest 1991;88:62-6.

3) Callander NS, Roodman GD Myeloma bone disease. Semin Hematol 2001;38:276-85.

4) Asosingh K, Radl J, Van Riet I, Van camp B, Vanderkerken K The 5TMM series: a useful in vivo model of human multiple myeloma. Haematol J 2000;1:351-6.

5) Gado K, Silva S, Paloczi K, Domjan G, Falus A. Mouse plasmacytoma: An experimental model of human multiple myeloma. Haematologica 2001;86:227-36.

6) Radl J, Croese JW, Zurcher C, Van Den Enden-Vieveen MHM, De Leeuw AM . Animal model of human disease: multiple myeloma. Am J Pathol. 1988;132:177-81.

7) Vanderkerken K, De Raeve H, Van Meirvenne S, Radl J, Van Riet I, Thielemans K, Van camp B. Organ involvement and phenotypic adhesion profile of the 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL/KaLwRij mouse. Brit J Cancer 1997;76:451-60.

8) Libouban H, Moreau MF, Lesourd M, Basle MF, Chappard D. Osteolytic bone lesions in the 5T2 multiple myeloma model: radiographic, scanning electron microscopic and microtomographic studies. J Histotechnol 2001;24:81-6.

9) Derenne S, Amiot M, Barillé S, Collette M, Robillard N, Berthaud P, Harousseau J-L, Bataille R. Zoledronate is a potent inhibitor of myeloma cell growth and secretion of IL-6 and MMP-1 by the tumoral environment. J Bone Miner Res 1999;14:2048-56.

10) Libouban H, Moreau MF, Baslé MF, Bataille R, Chappard D.Increased bone remodeling due to ovariectomy dramatically increases tumoral growth in the 5T2 multiple myeloma mouse model. Bone. 33, 283-292, 2003.

11) Libouban H, Moreau MF, Baslé MF, Bataille R, Chappard D. Selection of an highly agressive myeloma cell line by an altered bone microenvironment in the C57BL/KaLwRij mouse. Biochem. Biophys. Res. Commun. 316, 859-866, 2004.

12) Libouban H., Onno C., Grizon F., Moreau M.F., Baslé M.F., Chappard D. Absence of renal lesions in C57BL/KaLwRij mice with advanced myeloma due to 5T2MM cells. Leukaemia Res. 30, 1371–1375, 2006.

13) Benameur T., Chappard D., Fioleau E, Andriantsitohaina R, Martinez M.C., Marchand-Libouban H. Involvement of membrane microparticles in a mouse model of multiple myeloma. Micron, 54-55, 75-81, 2013.

14) N’diaye M., Libouban H., Aguado E., Audran M., Chappard D. Unwrapping microcomputed tomographic images for measuring cortical osteolytic lesions in the 5T2 murine model of myeloma treated by bisphosphonate. Micron, 68, 107-114, 2015.

15) Libouban H., The use of animal models in multiple myeloma. Morphologie. 2015 ; 99 :63-72

16) Libouban H., Chappard D.Altered bone remodeling due to dietary calcium deficiency increases osteolysis and modifies gene expression profile in a mouse model of myeloma. Micron en ligne 2017

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Figure 1 : lésions ostéolytiques de la voûte crânienne

 

 

 

 

Figure 2 :Radiographie de la patte droite d’une souris C57BL/KalwRij injectée avec des cellules 5T2MM, 16 semaines après inoculation. Noter l’existence de nombreuses lacunes ostéolytiques identiques à celles observées au cours du myélome humain.

 

Figure 3 : Souris C57BL/KalwRij injectée avec des cellules 5T2MM : aspect histologique, coupe non décalcif iée, coloration de Goldner. Noter l’invasion médullaire par les nodules myélomateux, la résorption quasi complète du tissu osseux trabéculaire et l’existence de perforations corticales.

 

 

 

Figure 4: Aspect en micro-tomographie X du fémur d’une souris C57BL/KalwRij ayant reçu une allogreffe de cellules 5T2MM. Reconstruction 3D : noter l’existence de nombreuses perforations qui s’étendent depuis l’endoste jusqu’à la face périostée de l’os, ainsi que la disparition complète du réseau trabéculaire.

Figure 4 bis: En haut: aspect en microCT 3D d'un fémur de souris avec des perforations dues à un myélome. Eb bas, même os après déroulement de l'ensemble des coupes 2d pour obtenir une image plane dans laquelle les perforations sont détectées (en rouge) et mesurées.

 

 

 

Figure 4 ter: A gauche aspect en microCT 3D des vertèbres lombaires de souris controle ; au centre, vertèbres d'une souris myélomateuse avec alimentation normale, notez les perforations dues au myélome. A droite, vertèbres d'une souris myélomateuse carencée en calcium. L'ostéolyse est considérable.

 

 

 

Figure 5: formule du pamidronate (aminobisphosphonate)

 

 

 

 

 

 

Figure 6: formule du zolédronate (aminobisphosphonate, Acide zolédronique)